Aug 19, 2023
Valvulogénesis de una raíz pulmonar viva inervada inducida por un andamio acelular
Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 1017 (2023) Citar este artículo 333 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La enfermedad de las válvulas cardíacas es una causa importante de mortalidad y morbilidad en todo el mundo con
Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 1017 (2023) Citar este artículo
333 Accesos
1 altmétrica
Detalles de métricas
La enfermedad de las válvulas cardíacas es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo, sin un tratamiento médico eficaz ni un sustituto valvular ideal que emule las funciones extremadamente sofisticadas de una válvula cardíaca viva. Estas funciones influyen en la supervivencia y la calidad de vida. Esto ha estimulado extensos intentos de ingeniería tisular de válvulas cardíacas "vivas". Estos intentos utilizaron combinaciones de células alogénicas/autólogas y andamios biológicos con cuestiones prácticas, regulatorias y éticas. La regeneración in situ depende de estructuras que atraen, albergan e instruyen a las células y promueven la formación de tejido conectivo. Describimos un andamio quirúrgico, acelular, sintético, novedoso, de ingeniería tisular, anatómicamente preciso, que induce un rápido proceso de morfogénesis que involucra tipos de células relevantes, matriz extracelular, elementos reguladores que incluyen nervios y componentes humorales. Este proceso se basa en características específicas del material, diseño y “morfodinamismo”.
La valvulopatía continúa siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en todo el mundo1 y no existe una terapia farmacológica eficaz para tratar la valvulopatía. El reemplazo valvular quirúrgico o percutáneo son los únicos métodos disponibles para tratar a pacientes con enfermedad valvular cardíaca avanzada. Hasta la fecha no existen sustitutos ideales de las válvulas cardíacas2,3. Las válvulas cardíacas nativas realizan funciones extremadamente sofisticadas4 que dependen de la viabilidad de sus componentes2. Estas funciones se traducen en puntos finales importantes como la longevidad y la calidad de vida2,5. Esto ha estimulado amplios intentos de ingeniería tisular para crear un sustituto de válvula cardíaca viva capaz de reproducir la mayoría o todas las funciones de la válvula nativa viva. La mayoría de estos intentos se basaron en el uso de diferentes células en combinación con una variedad de andamios6,7,8,9 o andamios descelularizados10,11,12,13. El uso de células y/o andamios fabricados de origen animal en la ingeniería de tejidos tiene importantes desventajas, como impedir su uso comercial, así como cuestiones éticas y prácticas. La regeneración in situ14,15,16,17,18,19 proporciona una plataforma para evitar el uso de células exógenas; los métodos exactos para lograrlo aún no están definidos5,20 y los mecanismos implicados siguen siendo desconocidos. Las válvulas de próxima generación diseñadas con tejidos15,21 deberían tener capacidad de reparación, remodelación y regeneración que emulen las propiedades de una válvula viva2 y durar toda la vida del paciente21. Aquí describimos el diseño de la válvula de componente compuesto Heart Biotech (HCCV), que se compone de un novedoso andamio de policaprolactona (PCL) pulverizado por chorro de múltiples capas22, que estimula la valvulogénesis in vivo. Esto se detalla en espacio y tiempo en un modelo ovino, y discutimos los mecanismos involucrados. Además, presentamos y discutimos la funcionalidad in vitro e in vivo del HCCV.
La HCCV es una válvula de componente compuesto PCL diseñada geométricamente de forma similar a la válvula semilunar humana nativa.
El andamio consiste en un andamio de PCL biocompatible, bioabsorbible, acelular y poroso con la geometría específica de una válvula semilunar nativa humana. Esto se basó en la reconstrucción 3D de imágenes de raíces aórticas normales, obtenidas del Aswan Heart Center tras la aprobación ética (Fig. 1a, b). El diseño se modificó ligeramente para mejorar la curvatura longitudinal de los senos de Valsalva y la altura de las valvas en un intento de mejorar la interacción entre líquido y sólido y mejorar la coaptación23 (Fig. 1c). Se creó un modelo de diseño asistido por computadora (CAD) de tamaño anular de 25 mm que representa la geometría externa (Fig. 1d), así como las superficies de las valvas (Fig. 1e). Los moldes se imprimieron en 3D en alcohol polivinílico (PVA) soluble en agua de un tercio de la válvula que consta de un seno y una valva combinados que se personalizaron para encajar en un soporte y contrapeso (Fig. 1e). Cada molde de seno/valvas se roció con chorro de PCL nanofibroso. Las nanofibras se rociaron con chorro de agua para producir un andamio anisotrópico con fibras predominantemente en la dirección circunferencial. Se incrustaron tres moldes de seno/valvas en un soporte (Fig. 1f) y este conjunto se roció con chorro (Fig. 1g). Sobre los senos se colocó un soporte tejido (patente EP 3 552 577 B1) con anillos de costura proximales y distales (Fig. 1h) y se volvió a rociar con chorro. El soporte de PCL tejido se creó mediante tejido por urdimbre en un diseño de jersey utilizando hilo PCL para permitir la expansión en la dirección circunferencial (Fig. 1i). Los moldes de PVA se retiraron disolviéndolos en agua para revelar el HCCV (Fig. 1j-l). Las paredes de los senos nasales consistían en un soporte tejido incrustado dentro de nanofibras de PCL pulverizadas por chorro (Fig. 1m) y las valvas consistían únicamente en nanofibras pulverizadas por chorro. Se utilizó SEM para caracterizar el tamaño de las nanofibras (media 0,38 µm (± 0,02)) y las imágenes representativas del andamio de nanofibras PCL (Fig. 1n-p) mostraron que el diámetro de los poros tenía un tamaño medio de 0,32 µm (± 0,03) con una mediana. de 0,24 µm (±0,04) (Fig. 1q) y de diferentes formas (Fig. 1o).
Una imagen escaneada por TC de una raíz aórtica normal utilizada como plantilla para diseñar el HCCV a; Segmentación de la región de la raíz b; Dibujo 2D de los componentes del HCCV (todas las unidades están en mm) c; diseño 3D asistido por ordenador (CAD) de la geometría exterior d; conjunto de válvula donde se modeló un tercio del HCCV con la forma de un solo seno, valva y un tercio de la arteria ascendente y se ensamblaron 3 de estos modelos de seno para crear el HCCV completo e. Se diseñó un soporte para albergar los 3 modelos de senos nasales y crear la arteria ascendente. Se diseñó un contramolde para encajar complementariamente los senos para crear los triángulos interfoliados y el anillo e. Tres moldes sinusales rociados con chorro y alojados en el soporte (arriba) con el contramolde (abajo) f. Todo el conjunto del molde se rocía con chorro g con el soporte tejido h. Imágenes que muestran el diseño del soporte tejido con 2 vistas de los senos nasales (arriba) y una vista de los senos nasales (abajo) con regiones de aumento de las diferentes regiones i. HCCV final después de la disolución de los moldes de PVA j que muestra la vista superior k y la vista anular l. SEM a través de la pared del seno que muestra el soporte tejido de PCL (fibras inferiores) y nanofibras (superior) × 150 m. SEM de nanofibras x5000 n; análisis de los espacios vacíos entre las nanofibras o, imagen de umbral p y un histograma de distribución del tamaño de poro (todos los datos se representan como media (± DE), n = 5, muestras independientes) q. Relaciones presión-flujo representativas de la válvula Medtronic Freestyle y HCCV r. Áreas geométricas representativas de los 3 folíolos s. Al área de apertura de cada folleto se le asignaron 3 colores diferentes para mostrar su sincronización entre la válvula Medtronic Freestyle (arriba, n = 1) y la HCCV (abajo, n = 1). Desgarros (indicados por un círculo negro) en 2 HCCV después de 9 millones de ciclos en el probador de desgaste acelerado t. Sección transversal del HCCV con gran aumento de la pared sinusal que muestra el soporte tejido incrustado dentro de nanofibras u.
Las pruebas hidrodinámicas del andamio HCCV (n = 4) y Medtronic Freestyle de 25 mm (n = 4) mostraron un área de orificio efectiva adecuada de 2,15 cm2 (±0,06) y 2,04 cm2 (±0,41) respectivamente, p = ns; insuficiencia pulmonar trivial a leve, 11,47% (±0,58) y 4,56% (±1,28) respectivamente, p = 0,0001; volúmenes de cierre de −7,02 ml (±1,75) y −0,82 ml (±0,23) respectivamente, p = 0,0004; volúmenes de fuga de −4,47 ml (±2,05) y −3,73 ml (±1,07), p = ns (Tabla 1, Fig. 1r). El gradiente de presión sistólica máxima de HCCV y Medtronic Freestyle fue de 23,37 mmHg (±1,11) y 23,46 mmHg (±3,43) respectivamente, p = ns. El movimiento instantáneo de las valvas mostró un alto grado de sincronía entre las tres valvas durante la apertura (Fig. 1s). La cinética de los folletos determinada por una cámara de alta velocidad (vídeos complementarios 2 y 3) mostró que el área del orificio geométrico de HCCV y la válvula Medtronic Freestyle fue de 3,13 cm2 (±0,14) y 2,21 cm2 (±0,14) respectivamente, p = 0,0001. La duración de la apertura de las valvas de las válvulas HCCV y Medtronic Freestyle fue de 0,325 s (±0,014) y 0,302 s (±0,018) respectivamente, p = ns. La tasa de apertura de las valvas de las válvulas HCCV y Freestyle fue de 74,15 cm2/s (±13,00) y 56,73 cm2/s (±11,42) respectivamente, p = ns. La velocidad de cierre de las valvas de las válvulas HCCV y Medtronic Freestyle fue de −29,54 cm2/s (±5,92) y −22,99 cm2/s (±2,72) respectivamente, p = ns. Las pruebas de durabilidad del HCCV despoblado demostraron una funcionalidad continua hasta 9 millones de ciclos, lo que equivale a un período de 3 meses, momento en el que se observaron pequeños desgarros en la región del abdomen (Fig. 1t). La microestructura del andamio HCCV mostró capas de nanofibras y el soporte tejido macrofibroso (Fig. 1u).
Tras la inserción del HCCV en posición pulmonar, se inicia un rápido programa de repoblación, simultáneamente desde el lado luminal y adventicial. Los HCCV se explantaron a intervalos de 1 semana (n = 1), 2 semanas (n = 1), 3 semanas (n = 1), 9 semanas (n = 1), 12 (n = 7) y 26 semanas (n = 4) (Figura complementaria 1).
Tras la implantación, la HCCV mostró una buena función visible sin fugas en los anillos anastomóticos (vídeo complementario 1) (Fig. 2a). A las 26 semanas posteriores a la implantación, las paredes de los senos nasales mostraron un aumento significativo en el grosor de 1,75 mm (±0,27) antes de la inserción a 6,76 mm (±1,28) (p < 0,0001), 5,35 mm (±1,70) (p < 0,0001). ) y 5,03 mm (±2,02) (p = 0,0001) después de la inserción para los senos anterior, izquierdo y derecho, respectivamente (Fig. 2b). Todos los velos a los 6 meses posteriores a la implantación experimentaron un grado menor y no significativo de retracción desde la altura original de 17,40 mm (±0,00): el anterior se retrajo hasta una altura media de 13,60 mm (±1,37 mm), el izquierdo orientado el folleto se retrajo a una media de 15,20 mm (± 2,83 mm) y los folletos orientados hacia la derecha se retrajeron a una altura de 13,80 mm (± 4,31 mm) (Fig. 2c). Hubo un aumento significativo en el grosor de las valvas desde una media de 0,62 mm (±0,02 mm) antes del implante a una media de 1,25 mm (±0,82 mm), a los 6 meses después de la implantación, p <0,0001. En el momento del explante, la apariencia macroscópica del HCCV, en todos los momentos, no mostró signos de calcificación o trombos (Fig. 2d-l). Las superficies eran lisas y se conservaba la forma de los senos nasales. Los folíolos eran delgados, flexibles con superficies brillantes y buena coaptación (2-4 mm). 8 de los 15 HCCV tuvieron pequeños desgarros con 1 HCCV a las 9 semanas (1 folíolo), 5 HCCV a las 12 semanas (7 folíolos) y 2 HCCV a las 26 semanas (2 folíolos) (2-3 mm de longitud) en las cúspides que originaban desde el borde de cobertura (Fig. 2i-l). En un análisis más detallado, el explante de 9 semanas mostró evidencia de infección en los folíolos pero no en la pared.
La vista funcional implantada del HCCV inmediatamente después de la implantación a. Gráficos que muestran el espesor medio de los senos b y la longitud media de los velos c a las 26 semanas después de la implantación, n = 4 (media ± DE) muestras biológicamente independientes) utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. La vista arterial del HCCV 1 semana después de la implantación d. Vistas abiertas de 4 HCCV a las 26 semanas después de la implantación ordenadas anterior, posterior derecha y posterior izquierda para cada HCCV e-h. Folletos que muestran la posición de las lágrimas a las 9 semanas i, 12 semanas j, k y 26 semanas l después de la implantación.
Al cabo de 1 semana de explantación, las primeras células que aparecieron dentro de la pared del seno fueron células CD45 positivas derivadas de la médula ósea (marcador panleucocitario) en mayor número desde el lado adventicial (Fig. 3a) con algunas células que penetraron en el centro de la pared del seno. andamio y dentro del soporte tejido (consulte la Tabla complementaria 1 para obtener información sobre anticuerpos). Además, hubo algunos miofibroblastos teñidos positivamente con α-SMA con depósito temprano de colágeno (Fig. 3b) en áreas irregulares solo en el lado luminal.
1 semana después de la implantación de HCCV que muestra imágenes representativas de la pared sinusal para inmunotinción con CD45 a, colágeno mediante EVG (*) en el lado luminal b; 2 semanas después de la implantación (ABSR y tinción con hematoxilina) c, cuadros ampliados en c d. Células que expresan α-SMA e, TEM que muestran morfología de fibroblastos f y miofibroblastos g, EC (CD31) que recubren neovasos (*) h, expresión de macrófagos M1 i, expresión de macrófagos M2 j, neovasos (*) y pericito k adyacente, TEM que muestra pericitos adyacentes a las CE l, m con conexiones de clavija/enchufe (círculos rojos). Colágeno n y elastogénesis en neovasos (*) o, neoíntima (flecha que indica elastina) p, neomedia q, cápsula incompleta (*) r, adipogénesis en neoadventicia (*) s por EVG. 3 semanas después de la implantación que muestran laminillas en los neovasos (EVG) t, α-SMA u y SMM v mediante inmunotinción, colágeno EVG w en la región tejida, vaina de elastina en el tejido externo (EVG) x, haz de nervios teñido con proteína de neurofilamento y, y FBGC (*) z. # Indica lado adventicial. Barras de escala: 250 µm en a, b, h, m, q, v; 500 µm en c, I; 100 µm en d, e, r, s, t, u; 1 µm en f, g, l; 5 µm en k; 25 µm en j, p; 50 µm en n, o, x, y y 1 mmm en w. E representa EC y P representa pericito.
En la semana 2, la pared del seno se remodeló en 2 capas que consistían en una neomedia que incorpora el soporte tejido y una neoadventicia con depósito concomitante de colágeno (Fig. 3c). Hubo una mayor abundancia de células pobladas, particularmente en la neoadventicia (Fig. 3c) en comparación con el lado luminal (Fig. 3d). Las células pobladas eran de diferentes fenotipos (células CD45 (marcador panleucocitario), miofibroblastos (SMA positivo) (Fig. 3e, f), fibroblastos (Fig. 3g), células endoteliales (CD31) (Fig. 3h), y clásicamente M1 proinflamatorio activado (CCR7) (Fig. 3i) y macrófagos antiinflamatorios M2 (CD163) alternativos activados (Fig. 3j). CD163 se expresó más abundantemente que CCR7. También se observaron escasas células gigantes de cuerpo extraño multinucleadas (FBGC). detectado. Se observó neoangiogénesis en esta etapa temprana, con un solo revestimiento endotelial presente (Fig. 3h, k). Estos se observaron dentro de la neoadventicia hasta el lado luminal del soporte tejido. Es importante destacar que estos neo-vasos mostraron la presencia de pericitos periféricos a través de conexiones de clavija y enchufe a las células endoteliales (CE) en sus lados abluminales (Fig. 3k-m). La aparición de adipogénesis se observó por primera vez en los bordes proximal y distal del HCCV dentro de la neoadventicia, albergando neo-vasos (Fig. 3e, s).
En esta etapa, se detectaron fibras de colágeno predominantemente en una dirección longitudinal en ambos lados del soporte tejido con fibras longitudinales extendiéndose a través del soporte tejido (Fig. 3n). Se observó elastogénesis en forma de finas fibras de elastina en los neovasos (Fig. 3o), neoíntima (Fig. 3p), neomedia (Fig. 3q), y en el inicio de una vaina incompleta en el neoadventicia exterior (Fig. 3r).
El explante de 3 semanas se caracterizó por un mayor desarrollo de la pared arterial y los vasa vasorum con inicios de laminillas (Fig. 3t) en la media y adventicia que contienen células de músculo liso (SMC) que expresan fuertemente α-SMA (Fig. 3u). y expresión ligeramente más débil de miosina del músculo liso (SMM) (Fig. 3v). La mayoría de las células en los medios neo-se tiñeron positivamente para α-SMA y SMM. Se observó una mayor deposición de colágeno a ambos lados del soporte tejido por fibroblastos y miofibroblastos, particularmente en el lado adventicia con puentes más gruesos de colágeno a través del soporte tejido (Fig. 3w, x). Esto estuvo acompañado de una mayor elastogénesis en forma de una fina vaina (Fig. 3x) en el tejido exterior que simula la lámina elástica externa.
Una característica nueva y emocionante fue la aparición de un pequeño grupo de haces de nervios amielínicos (300 a 400 µm de diámetro) que expresaban débilmente la proteína neurofilamento marcadora neural (Fig. 3y) formada in situ en el tejido adiposo recién formado adyacente a los neovasos. Los FBGC multinucleados (Fig. 3z), así como los macrófagos M1 y M2 aumentaron en número en la adventicia y en el soporte tejido.
El explante de 9 semanas mostró una síntesis mejorada de colágeno en el soporte tejido y la adventicia externa (Fig. 4a). Se observó expansión de los haces de nervios teñidos con proteína de neurofilamento (Fig. 4b) en número (5-12) y tamaño (40 µm-1,3 mm de diámetro) en el seno externo adyacente a los vasos grandes y dentro del tejido adiposo teñido con FABP4 (Fig. 4c) y leptina (Fig. 4d). La pared del seno estaba completamente celularizada (Fig. 4e) con una combinación de fibroblastos, miofibroblastos (tinción positiva para α-SMA) y macrófagos M1, M2 y una capa de FBGC que recubrían la neomedia externa (Fig. 4e). Por primera vez se demostró una capa irregular de células endoteliales (CE) cúbicas que expresan vWF en la superficie de la pared del seno (Fig. 4f) y EC longitudinales ocasionales en las valvas (Fig. 4g). Es importante destacar que estas células tenían la morfología (Fig. 4h, i) y la ultraestructura de las CE normales (Fig. 4j). En la superficie externa de la adventicia de una pared sinusal había una vaina incompleta que constaba de colágeno y fibras elásticas (Fig. 4k). Todas las células repobladoras y la ECM parecían originarse en la circulación y los tejidos circundantes en los sitios anastomóticos.
HCCV que muestra depósito de colágeno teñido con EVG a, haces de nervios inmunoteñidos teñidos con proteína de neurofilamento b, incrustados dentro de tejido adiposo en expansión teñido con FABP4 en el lado adventicial c a las 9 semanas después de la implantación y leptina d a las 12 semanas después de la implantación. Celularización completa de la pared sinusal teñida con H&E que muestra una capa de FBGC multicelulares (*) e, EC cuboidales en la pared sinusal f, EC longitudinales en el lado arterial de las valvas g teñidas con CD31, SEM de EC en la pared sinusal h , i, TEM de EC j a las 9 semanas después de la implantación, cápsula de elastina incompleta teñida con EVG k a las 9 semanas después de la implantación, haces de nervios teñidos con VIP l, TH m, NPY n y proteína de neurofilamento o a las 12 semanas después de la implantación. implantación. Barras de escala: 500 µm en a, b y k; 250 µm en l, m, n, o; 100 µm en c, d, e, f, g; 10 µm en el panel h; 5 µm en i y 0,5 µm en j.
Los 7 explantes a las 12 semanas posteriores a la implantación mostraron una remodelación y fortalecimiento continuos por parte del colágeno. Había muchos haces de nervios (~ 20) en los senos paranasales de los 7 HCCV que se tiñeron positivamente para el péptido vasointestinal (VIP) (Fig. 4l), tirosina hidroxilasa (TH) (Fig. 4m), neuropéptido Y (NPY) (Fig. 4n) y proteína de neurofilamento (NF) (Fig. 4o). VIP y NPY también tiñeron algunas de las SMC de la vasculatura (Fig. 4l, n). El andamio estaba poblado por FBGC a lo largo de la pared de los senos paranasales y hasta la región de la bisagra. Se observó una capa continua de CE en las paredes de los senos nasales que se encontraban encima de una capa fibrosa formada por miofibroblastos y fibroblastos. La mayoría de los lados arteriales de los velos estaban cubiertos de CE (Fig. 4g).
A las 26 semanas hubo una mayor maduración de todas las capas de la pared sinusal y de los componentes celulares y de la ECM, que soportan fuertemente la pared arterial mediante el entrelazado de fibras de colágeno, tejido elástico y SMC. En esta etapa, había una capa adventicial muy bien desarrollada que contenía elementos reguladores como nervios, vasa vasorum y tejido adiposo blanco (Fig. 5a). 3 de los 4 explantes a las 26 semanas mostraron la presencia de muchos haces de nervios positivos para tirosina hidroxilasa (Fig. 5b), neuropéptido Y (Fig. 5c) y proteína de neurofilamento (Fig. 5d) en diversos grados en cada haz, también como tinción positiva para plata, que son marcadores de tejido neural maduro (Fig. 5e). La ultraestructura de los axones y las células de Schwann también se confirmó mediante microscopía electrónica (Fig. 5f, g).
HCCV que muestra la maduración de los vasos que residen en la capa adiposa adventicial adyacente a un haz de nervios teñido con EVG a; Haz nervioso b inmunoteñido con tirosina hidroxilasa, neuropéptido Y c, proteína de neurofilamento d, haz nervioso e teñido con plata, ultraestructura de los haces nerviosos mediante TEM f, g, inmunotinción VwF en la pared sinusal h, lado arterial de la valva i, membrana basal EC teñida con EVG j , inmunotinción de elastina k, α-SMA l, SMM m, coexpresión de CD31 (rojo) y α-SMA (verde) n, sección completa de la raíz que muestra tejido adiposo, tinción de elastina y colágeno mediante EVG o, paneles ampliados que muestran tejido adiposo con haces de nervios y vasos p, colágeno arrastrándose sobre la cara ventricular de la valva q. Folleto retraído r, raíz pulmonar normal s que muestra tejido adiposo que alberga un haz de nervios y vasos muy próximos con imagen ampliada t. Folleto de HCCV inmunoteñido con α-SMA u, CD163 v. La parte superior en u y v es el lado arterial de los folletos. Barras de escala: 100 µm en a–c; 50 µm en d, e, h, i, j, k, l, m; 2 µm en f; 5 µm en g; 20 µm en n; 10 µm en o; 1 mm en p, q; 2,5 mm en s; 500 µm en u y 250 µm en v.
Se formó un revestimiento endotelial continuo teñido con vWF (Fig. 5h) en la pared del seno con una capa íntima bien definida y una lámina elástica interna (Fig. 5j). El revestimiento endotelial (vWF) de las valvas estaba casi completo (Fig. 5i). Las CE y la íntima expresaron elastina (Fig. 5k), α-SMA (Fig. 5l) y SMM (Fig. 5m) en los senos nasales (similar a la pared sinusal de una oveja normal (Fig. 2 complementaria)). Las CE en el lado luminal de la pared del seno y los microvasos mostraron una transformación endotelial a mesenquimatosa (EndMT) mediante la coexpresión del marcador EC (CD31) y el marcador mesenquimatoso α-SMA (Fig. 5n). Los fibroblastos, detectados por su morfología y ultraestructura mediante microscopía electrónica de transmisión (Fig. 5g), y los miofibroblastos, detectados mediante α-SMA sin la presencia de SMM, se encontraron en toda la pared del seno, incluida la capa fibrótica, que se encuentra debajo del endotelio del seno. a ambos lados del andamio, dentro de la capa tejida, la neomedia y la adventicia. Había una mayor cantidad de tejido adiposo (Fig. 5o, p), similar a la pared del seno pulmonar normal (Fig. 5s, t). Este contenía adipocitos blancos que albergaban neuronas y vasos (Fig. 5o, p). La región de la bisagra estaba sostenida por una capa de colágeno ubicada a lo largo del ventricular (Fig. 5p, q). De los 4 HCCV explantados a las 26 semanas, solo uno de los 12 folletos mostró retracción (Fig. 5r).
En los folíolos no había depósitos de colágeno, elastina o proteoglicanos. Las células eran predominantemente del fenotipo miofibroblástico (Fig. 5u), fibroblástico, endotelial, M2 (Fig. 5v) y FBGC, con una incidencia decreciente. La región bisagra sigue un lento proceso de recelularización similar al observado en los folíolos.
La ecocardiografía in vivo del HCCV mostró un buen movimiento y coaptación de las valvas con una regurgitación mínima (Fig. 6a-l, Fig. complementaria 4). La geometría y función generadas por resonancia magnética mostraron una forma de raíz conservada con senos pronunciados (Fig. 6m), tamaño y función conservados del ventrículo derecho (Fig. 6n) con volúmenes sistólicos finales (ES) y diastólicos finales (ED) conservados. No hubo evidencia de estenosis o regurgitación del HCCV. Hubo una excelente coincidencia de tamaño entre el HCCV y el tracto de salida del ventrículo derecho (Fig. 6m). La determinación del flujo instantáneo por resonancia magnética mostró trazados casi normales (Fig. 6o). La dinámica de fluidos computacional (CFD) mostró líneas de corriente paralelas en la arteria pulmonar principal durante la fase sistólica y formación de doble hélice en las ramas principales durante la diástole (Fig. 6p), sin mostrar ninguna aceleración anormal similar a la de la oveja normal (control), (Fig. .6q). El análisis de tensión de las raíces del HCCV se realizó mediante resonancia magnética en el abultamiento máximo del seno pulmonar durante el ciclo cardíaco. La cepa medida a los 6 meses para HCCV (n = 5) fue 0,42 (±0,16) en comparación con 0,51 (±0,08) en ovejas nativas (n = 3), aunque parece haber una disminución en la cepa para la raíz de HCCV, esto la diferencia no es estadísticamente significativa.
La primera fila muestra los ecocardiogramas del HCCV en el implante durante la sístole a y la diástole b, seguidos de la ecografía Doppler que muestra el flujo laminar durante la sístole cy una regurgitación mínima durante la diástole d. La segunda fila muestra el HCCV a los 2 meses durante la sístole e y la diástole f, seguido de la ecografía Doppler durante la sístole g y la diástole h. La tercera fila muestra el HCCV a los 6 meses durante la sístole i y la diástole j, seguido de una ecografía Doppler que muestra la sístole k y trazas de regurgitación durante la diástole l. La resonancia magnética generó la geometría de la raíz de 3 HCCV y un control a las 26 semanas posteriores a la implantación m. Ventriculograma generado por resonancia magnética que muestra los ventrículos derecho (amarillo) e izquierdo (rojo) en 3 HCCV y un control n, flujo instantáneo de HCCV en el anillo (PS, sístole máxima; LD, diástole tardía: ED, diástole temprana) o, CFD que muestra el patrón de flujo a través de la bifurcación de la arteria pulmonar de un HCCV y 2 vórtices opuestos p, CFD que muestra líneas de velocidad paralelas en un control (oveja normal) y a través de 2 HCCV en el pico de sístole a los 6 meses después de la implantación q. Peso molecular de nanofibras de PCL originales e implantadas durante 26 semanas en valvas, senos nasales y soporte tejido (todos los datos se representan con media ± DE, n = 3, (muestras biológicamente independientes) r, análisis SEM de fibras tejidas antes de la implantación s y después de t a ×1000 (flechas rojas que indican erosión), SEM de nanofibras antes de la implantación de u y después de v a ×5000 (flecha roja que indica "picaduras"). Las barras de escala son de 5 µm en s y t; 10 µm en u y v.
La cromatografía de permeación en gel mostró una degradación significativa de las nanofibras PCL a los 6 meses desde la nanofibra PCL original con un PM promedio de 118374 Da (±1349) a un PM promedio de 99734 Da (±3070) para nanofibras dentro de los folíolos (p = 0,0029) y un PM promedio de 102573 Da. (±8726) para las paredes de los senos nasales (p = 0,0091) (Fig. 6r). No hubo diferencias significativas en los PM entre las muestras analizadas en los folletos y las analizadas en los senos nasales después de 6 meses de implantación. El soporte tejido PCL mostró una degradación lenta a los 6 meses desde el soporte original con un PM promedio de 80554 Da (± 708) a un PM promedio de 63489 Da (± 2983), p = 0.0054 (Fig. 6r). El análisis SEM de las fibras tejidas mostró degradación de su superficie lisa (Fig. 6s, t), mientras que las nanofibras mostraron algunas "picaduras" después de 6 meses de implantación (Fig. 6u, v).
De los 14 HCCV explantados, solo 1 valva mostró un nódulo muy pequeño de calcificación a los 6 meses (500 µm de diámetro) que no afectó la función de la válvula (Figuras complementarias 3a-c). No hubo signos de calcificación en ninguno de los senos.
Este manuscrito muestra por primera vez que tras la inserción de un armazón acelular de diseño específico de múltiples capas22,24, hay un programa activo de morfogénesis valvular que da como resultado una válvula viva y funcional. El diseño aprovecha la interacción sólido-líquido23, el morfodinamismo4,23, el estrés compartido entre los senos y las valvas25, y el tamaño y la forma específicos de los poros en el andamio26,27.
La funcionalidad in vitro del armazón HCCV mostró un área de orificio efectiva adecuada y un gradiente de presión sistólica máxima en comparación con Medtronic Freestyle. La fracción de regurgitación del HCCV estuvo por debajo del requisito estándar ISO del 15 %; sin embargo, fue significativamente mayor que la del Medtronic Freestyle, debido principalmente al creciente volumen de cierre del HCCV. Es probable que esto se deba al área del orificio geométrico significativamente mayor del HCCV. Sin embargo, tras la repoblación del armazón, los estudios in vivo mostraron trazas de regurgitación que no afectaron el volumen ventricular. Las pruebas de durabilidad in vitro del andamio HCCV mostraron funcionalidad hasta 9 millones de ciclos (equivalente a un período de 3 meses de ciclos cardíacos normales) en el momento en que aparecieron desgarros. Sin embargo, in vivo, el HCCV superó esto con un buen rendimiento funcional durante hasta 6 meses debido a la capacidad de remodelación del andamio. De manera similar, la válvula descelularizada de tritubo excedió el número de ciclos in vitro hasta fallar28. La funcionalidad de la HCCV también se mantuvo según lo respaldado por los resultados del eco sin signos de estenosis o regurgitación significativa. Además, la resonancia magnética mostró el tamaño y la forma conservados de los ventrículos, lo que demuestra la buena funcionalidad del HCCV durante todo el tiempo de implantación.
El programa de remodelación está asociado con el reclutamiento y diferenciación de células al fenotipo relevante como en la válvula nativa, como SMC, miofibroblastos, fibroblastos y EC29,30,31 con la producción y estratificación de los componentes de la matriz extracelular. Las capas de las valvas del HCCV no eran tan maduras como las de las valvas pulmonares normales; sin embargo, las capas de las paredes de los senos paranasales del HCCV eran comparables a las de una pared del seno pulmonar normal con capas íntima, medial y adventicia definidas32,33. La morfogénesis valvular es un proceso extremadamente complejo34 que involucra vías genéticas, mecánicas y moleculares con interacciones de múltiples tipos de células. El proceso espaciotemporal de morfogénesis inducido por la estructura es similar, pero no idéntico, al que se produce durante el desarrollo valvular34,35. Esto incluye interacciones en la superficie celular, entre fibroblastos, miofibroblastos activados, pericitos, CE, células inmunes, SMC y ECM27,36. Observamos miofibroblastos activados 2 semanas después de la inserción, que aumentaron en número con el tiempo, particularmente en la capa neoadventicial seguida de la neomedia y la neoíntima. Estas células participaron en la producción de colágeno, elastina y otros elementos de la ECM. Se detectaron CE en la superficie del andamio así como en los neovasos a las 2 semanas y mostraron una apariencia de adoquín que expresaba CD31 a las 9 semanas. A las 12 semanas había una capa de CE casi completa en las paredes de los senos nasales. Se observaron pericitos adyacentes a las CE de los neovasos. Se cree que las CE y los pericitos en los neovasos desempeñan un papel vital en la angiogénesis y la adipogénesis37,38. Se sabe que los pericitos influyen en el desarrollo y función de las CE en las paredes arteriales39. La evidencia de EndMT se observó por primera vez a las 9 semanas en las CE íntimas. EndMT desempeña un papel importante en la valvulogénesis al repoblar las valvas con nuevas células que influyen en la homeostasis de la válvula a largo plazo34,40. Los vasos recién formados estaban estrechamente asociados con haces de nervios. La composición celular de la pared del HCCV se acercó a la de la pared del seno nativo a los 6 meses con EC en la superficie, SMC en el medio, miofibroblastos, fibroblastos, adipocitos y neuronas en la adventicia. Sin embargo, los macrófagos y las células gigantes de cuerpos extraños persistieron a los 6 meses. Se demostró que los macrófagos son las células “pioneras” en la remodelación de una válvula pulmonar porcina descelularizada12. La respuesta al cuerpo extraño y la cicatrización de heridas son los mecanismos más hipotéticos para la integración y remodelación del andamio17,41,42.
Una característica única e importante es el desarrollo de tejido neurogénico a las 3 semanas y que aumenta progresivamente con el tiempo. Estos nervios expresaban varios neurotransmisores, que podrían desempeñar un papel importante en la reducción de la respuesta inflamatoria43. La presencia de nervios no se ha documentado en ninguna otra válvula diseñada con tejido. Los nervios desempeñan un papel regulador importante en el desarrollo, la maduración y la fisiología normal de las válvulas44,45 y se ha demostrado que las fibras nerviosas se originan en la pared adventicial46. Se ha demostrado la neurogénesis in situ mediante una estructura porosa y acelular, pero esto fue en un modelo de lesión nerviosa47.
El tejido adiposo blanco se observó por primera vez en la neoadventicia externa 3 semanas después del desarrollo de la angiogénesis48. Este tejido adiposo puede contribuir al comportamiento mecánico único de la pared del seno pulmonar que actúa como un "colchón" similar al observado en la pared del seno pulmonar normal. El tejido adiposo tiene muchas funciones reguladoras y metabólicas, que podrían ser relevantes para la morfogénesis y la función de la válvula madura49 y no se han documentado en ninguna otra válvula diseñada con tejido. El desarrollo de la adventicia en válvulas diseñadas con tejidos está poco documentado, pero puede ser el principal regulador de la fisiología y patobiología de la pared con funciones funcionales y estructurales50. La red neuronal en la adventicia libera neurotransmisores adrenérgicos, colinérgicos, peptidérgicos, purinérgicos y nitrérgicos que conducen a la contracción o relajación del SMC50. La identificación de estos en el HCCV está en curso con una disponibilidad limitada de anticuerpos específicos de oveja. La adventicia también es una fuente de células madre y progenitoras residentes para la renovación y diferenciación celular50,51.
El desarrollo de múltiples capas en la pared sinusal se inició en la semana 3, y en la semana 9 incluía una capa íntima que contenía fibras elásticas y fibroblastos, una neomedia que contenía células similares a miofibroblastos y fibras elásticas y una capa fibrosa circunferencial alrededor del soporte interno. conectado con puentes de colágeno. Este funcionó como soporte principal de la pared sinusal. La neoadventicia comenzó a aparecer a las 3 semanas aumentando progresivamente de tamaño. Se sabe que esto desempeña un importante papel regulador en el funcionamiento de los buques52. Esta remodelación temprana del HCCV es favorable ya que el armazón comienza a degradarse desde el punto de implantación. Por el contrario, la cobertura íntima temprana de las válvulas XPV y Gen 1 no se documentó ya que el momento más temprano de los estudios fue a los 2 y 3 meses respectivamente18,28.
El proceso de morfogénesis avanzó en los senos nasales 26 semanas y esto se atribuyó a las características del diseño, en particular la inclusión del soporte tejido en los senos nasales. La repoblación de las valvas y el mecanismo de bisagra fue significativamente más lenta, similar a la de Xeltis y las válvulas Gen 1 y 218,28. Sin embargo, Kluin et al. han mostrado abundantes células circulantes en toda la estructura microporosa de su válvula a los 2 meses53.
La población diversa de células que repoblan el andamio se origina a partir de células circulantes. Entran al armazón desde la superficie adventicia y el lado luminal, y la primera parece ser la ruta dominante. La neovasculatura puede actuar como un sitio de entrada adicional de las células, y el pannus que se extiende sobre el HCCV también permite el reclutamiento de células de un tejido cercano. Se necesitan estudios futuros para identificar rutas para el reclutamiento de células en neofolíolos.
Todos estos procesos dieron como resultado una válvula altamente funcional con apertura rápida y sin evidencia de obstrucción o regurgitación. La respuesta del ventrículo derecho y el patrón de flujo en la arteria distal reflejaban la función sofisticada de una válvula viva. Los ecos secuenciales y las resonancias magnéticas han mostrado una forma sinusal conservada del HCCV, un tamaño y un patrón de flujo del ventrículo derecho conservados en comparación con las ovejas normales, así como una ausencia de estenosis. El estudio actual es el primero en utilizar resonancia magnética secuencial posterior a la implantación para generar datos anatómicos y funcionales relacionados con el HCCV.
La retracción de las valvas ha sido problemática en las válvulas diseñadas con tejidos; sin embargo, esto se observó en solo 1 de cada 12 valvas en nuestro estudio, comparativamente menos que en otros estudios. Para anticipar/evitar este problema de retracción, el HCCV ha sido diseñado con una valva media de mayor altura para mantener la coaptación. Otras válvulas diseñadas con tejidos también han mostrado un pliegue leve y severo en algunos casos hasta el punto en que la valva se había fusionado a la pared del seno18,54, contracción en todas las valvas10,55 y una reducción significativa en la longitud media de las cúspides54,56.
El hilo de PCL nanofibroso y el hilo de PCL macrofibroso mostraron un nivel similar de degradación según lo evaluado por GPC, lo que sugiere que la degradación hidrolítica es el modo principal de descomposición y no la degradación enzimática celular, ya que los senos paranasales estaban altamente poblados de células en comparación con los folíolos. Por el contrario, la válvula Xeltis mostró una absorción/degradación más avanzada en el conducto en comparación con las valvas18 debido al uso de diferentes polímeros con diferentes tasas de degradación en cada ubicación. La válvula con stent producida por Kluin et al. mostró una modesta disminución en el peso molecular de todas las fibras con la desaparición del polímero después de 12 meses en regiones ricas en células53.
Se observó un nódulo muy pequeño de calcificación en sólo 1 prospecto de 4 HCCV a los 6 meses y en ninguno de los senos paranasales. Este es un resultado similar al de la válvula Xeltis con calcificación de las valvas en 1 valva de 5 válvulas18 y en una válvula de tres tubos que mostró microcalcificación puntiforme en algunas regiones de las valvas28. Kluin et al. demostró que solo había escasas manchas en dos explantes de 12 meses53. El modelo de oveja es particularmente propenso a la calcificación, por lo que nuestro resultado es favorable.
Las limitaciones del estudio incluyen la pequeña cantidad de animales en los primeros momentos, un período de seguimiento relativamente corto y la falta de experimentos que demuestren la capacidad de crecimiento. La repoblación más lenta de las valvas requiere mayor investigación y es similar a otras válvulas12,28. La observación de pequeños desgarros en 7 de los 15 HCCV es otra limitación, aunque los desgarros en 1 explante se debieron a una infección; sin embargo, estas lágrimas eran extremadamente pequeñas y estaban rodeadas de tejido vivo, lo que podría limitar su extensión y estimular la curación. Estos desgarros se produjeron en puntos de gran tensión, en los bordes de coaptación y en las comisuras, y el riesgo de desgarro se reduciría engrosando ligeramente los folíolos.
Los nuevos hallazgos en la remodelación del HCCV muestran una elastogénesis temprana en los senos nasales con adipogénesis en la pared externa del seno para incluir los sistemas angiogénico y neurogénico. La documentación de la repoblación del HCCV con células y ECM apropiadas, tanto estructural como funcionalmente, es extremadamente prometedora y debería traducirse en resultados clínicamente relevantes, tanto en términos de calidad de vida como de longevidad, cuando se utilice en el hombre.
La creación y fabricación del HCCV implicó un proceso de varios pasos. En primer lugar, el modelado 3D de la raíz pulmonar se basó en imágenes de raíces aórticas normales proporcionadas por el Centro del Corazón de Aswan. Las imágenes se segmentaron utilizando Mimics (Materialise NV, Bélgica) y se utilizaron para crear moldes en Solidworks (Dassault Systèmes). El diseño se modificó ligeramente para extender la curvatura longitudinal de los senos de Valsalva y la altura de las valvas en un intento de mejorar la interacción entre líquido y sólido y mejorar la coaptación23 (Fig. 1c). Se creó un modelo de diseño asistido por computadora (CAD) de tamaño anular de 25 mm que representa la geometría externa (Fig. 1d), así como las superficies de las valvas (Fig. 1e). Cada cúspide se modeló por separado con un contrapeso removible para permitir una rotación a alta velocidad. Se diseñaron un soporte y un contramolde para mantener juntas las 3 cúspides con la ayuda de una estructura en Y para imitar la forma de la raíz. Los moldes individuales se imprimieron en 3D en alcohol polivinílico (PVA) utilizando una impresora 3D (Ultimaker 3), excepto la estructura en Y, que se mecanizó mediante CNC en titanio para soporte mecánico (Protolab) (Fig. 1e). En segundo lugar, pulverización por chorro de andamios de nanofibras: este proceso se describió anteriormente y se modificó para adaptarse al proceso de pulverización de moldes de varias partes22. Brevemente, se pasa aire comprimido a través de un pulverizador de chorro hecho a medida mientras se extruye la solución de policaprolactona (PCL) al 10 % p/v a 35 ml/hora utilizando una bomba de jeringa (Alaris Guardrails Plus). El pulverizador Jet se hizo funcionar a presiones de 7 bar a través de una boquilla cónica de acero inoxidable de 500 µm de diámetro y una aguja de 120 µm de diámetro. El pulverizador de chorro está montado en una plataforma XYZ para pulverizar la nanofibra PCL sobre los moldes a una distancia de 30 cm. Cada molde sinusal se montó en un mandril giratorio y se hizo girar a 10000 rpm con una velocidad superficial estimada de 12,38 m/s para que el molde de cúspide formara nanofibras alineadas. Las 3 cúspides se rociaron por separado y luego se montaron en el soporte como se muestra en la Fig. 1e, f. El molde ensamblado se roció con chorro a 500 rpm con una velocidad superficial promedio de 0,65 m/s para formar la primera capa exterior no alineada. El espesor de las capas nanofibrosas se midió utilizando un perfilador de espesor confocal sin contacto (Micro-epsilon, Reino Unido) con 10 puntos de medición por modelo. En tercer lugar, creación de una estructura de soporte tejida: se utilizó el software de tejido Stoll M1 plus para diseñar diferentes regiones de la estructura de soporte con diferentes tensiones para soportar la presión pulmonar y soportar la retención de la sutura (patente EP 3 552 577 B1). El hilo PCL, 220 dtex (EMS-Griltech), se utiliza para tejer por urdimbre un patrón específico con tensiones regionales para adaptarse a la forma y rigidez de la válvula normal, al tiempo que permite la expansión en la dirección circunferencial (Fig. 1i) en un plano Stoll. -Máquina de tejer de cama (Stoll, Reino Unido). El soporte tejido con anillos de costura proximales y distales se colocó encima de los senos nasales (Fig. 1h) sobre la válvula ensamblada rociada y luego se roció con chorro nuevamente a 500 rpm como se describió anteriormente. Por último, el proceso de soldadura con solvente: se usó acetato de etilo para soldar las fibras de PCL entre las capas sinusales externas de los moldes sinusales y la capa externa completa sobre los 3 moldes sinusales completos. El proceso se optimizó para proporcionar una buena adhesión entre las capas de PCL manteniendo al mismo tiempo la porosidad para la penetración celular. Esto se logró mediante 30 minutos de soldadura con solvente con 15 ml de acetato de etilo a 30 °C usando una cámara hermética de 2 L hecha a medida. El molde con la capa exterior pulverizada se colocó en una cámara hermética que contenía una sonda de temperatura y se colocó en un rotador para una distribución homogénea del vapor de acetato de etilo. Esto aseguró la saturación de la cámara y una soldadura uniforme con solvente. Las válvulas completadas se colocaron en un desecador al vacío durante 48 h para eliminar cualquier disolvente residual. Después de eliminar el disolvente residual, la válvula pulverizada por chorro se sumergió en un baño de agua a 45 °C para que se disolvieran los moldes de PVA. A medida que los moldes se disolvieron, se retiró el puntal en Y para evitar daños a las cúspides. Una vez completamente disuelta, la válvula se secó en una cabina de flujo laminar después de intercambiarla con etanol al 100% 3 veces a intervalos de 1 h. Las válvulas secas se enviaron para esterilización con óxido de etileno a 35 °C (Test Ltd, Reino Unido) antes de la implementación in vivo.
El andamio resultante consiste en un polímero de policaprolactona (PCL) biocompatible, bioabsorbible, acelular y poroso con la geometría específica de una válvula semilunar nativa humana (Fig. 1j-l). Las paredes de los senos nasales consistían en un soporte tejido incrustado dentro de nanofibras de PCL pulverizadas por chorro (Fig. 1m) y las valvas consistían únicamente en nanofibras pulverizadas por chorro (Fig. 1n).
Se montaron nanofibras pulverizadas por chorro y soporte tejido en soportes de muestras de aluminio con cinta de carbono y recubrimiento por pulverización catódica con oro/paladio (Emitech K550X, Quorum Technologies Ltd, Kent, Reino Unido). Las imágenes se tomaron con un microscopio de barrido analítico JEOL JSM 6010LA. Las imágenes adquiridas se analizaron utilizando Image J.
El rendimiento hidrodinámico del HCCV se evaluó utilizando un duplicador de pulsos (Vivitro Superpump System SP3891, Vivitro, Victoria, BC, Canadá). Se replicaron presiones y flujos pulmonares fisiológicamente equivalentes de acuerdo con los requisitos de la norma ISO 5840-2:2021. La válvula se montó en la cámara de prueba aórtica y se probó con un gasto cardíaco (CO) de 7 L/min, una cámara de distensibilidad de 2 L, un adaptador de impedancia viscoelástico con una distensibilidad de fuente y salida establecida en 10 ml y 40 ml, una presión arterial media de 20 mmHg, una frecuencia cardíaca fija de 70 latidos por minuto y la sístole ocupa el 35% del ciclo cardíaco. Se utilizó solución salina a 37 °C como fluido de prueba. Se utilizó el software ViViTest para registrar la presión arterial media estable, el flujo del gasto cardíaco, las mediciones de las presiones auricular, ventricular y aórtica y el flujo aórtico durante 10 ciclos cardíacos consecutivos. La fracción regurgitante total representa el volumen regurgitante expresado como porcentaje del volumen sistólico57. El área efectiva del orificio (EOA), que representa el área transversal mínima del chorro aguas abajo que emerge del orificio de la válvula aórtica, se derivó de la ecuación de continuidad, aplicando la fórmula de Gorlin58. El porcentaje del área del orificio geométrico se capturó utilizando una cámara de alta velocidad a 480 FPS (Sony, Reino Unido), seguida del código interno Matlab (Mathworks) para el análisis de imágenes59.
La durabilidad funcional de la válvula se evaluó en una configuración de prueba de desgaste acelerado (AWT) in vitro, utilizando un sistema AWT VDT3600i (BDC Laboratories, CO, EE. UU.). La válvula se montó en una cámara de prueba, con solución salina tamponada a 37 ± 1 °C con 1 g/l de líquido de prueba de azida sódica como fungicida y bactericida, funcionando a una velocidad de ciclo de 5 Hz, configurada para mantener una presión diferencial máxima por encima de 40 mmHg. a través de la válvula cerrada durante al menos el 5% de cada ciclo. El software del sistema proporciona un monitoreo continuo de las presiones diferenciales en tiempo real, registrando solo los ciclos en los que las condiciones de presión cumplieron con los requisitos de prueba especificados. La prueba estaba programada para ejecutarse hasta que fallara. La válvula se inspeccionó visualmente diariamente para detectar signos de daño y se evaluó funcionalmente en el duplicador de pulso antes y después de completar cada 5 millones de ciclos.
Se llevaron a cabo dos estudios de modelos ovinos en Mfd Diagnostics GmbH (Wendelsheim, Alemania) (aprobación ética del protocolo G18-15-067 del Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Alemania) por parte de un laboratorio independiente y las autoridades locales alemanas, según corresponda, y en una instalación holandesa. tras la aprobación ética. En los Países Bajos se llevó a cabo un estudio con un modelo ovino. La aprobación para los estudios con animales fue obtenida por el Comité de Ética del Cuidado de Animales de los Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam (AVD1180020197705) y están de acuerdo con la actual ley holandesa sobre experimentos con animales (WOD). Hasta la fecha, 24 ovejas se han sometido a un reemplazo de válvula pulmonar utilizando el HCCV (Figura 2 complementaria) y las ovejas fueron aleatorizadas para la duración del seguimiento. La válvula se explantó en diferentes intervalos postoperatorios, 1 semana (n = 1), 2 semanas (n = 1), 3 semanas (n = 1), 9 semanas (n = 1), 12 semanas (n = 7) y 26 semanas (n = 4). 24 hembras de oveja Swifter (peso promedio, 50 ± 5 kg, edad promedio 1 año) se sometieron a reemplazo de la válvula pulmonar y la arteria pulmonar principal con HCCV de 25 mm. Para la implantación en Alemania, la anestesia se indujo con 2 mg/kg de ketamina, 0,02 mg/kg de atropina y una infusión intravenosa en bolo de 2 mg/kg de propofol. La anestesia se mantuvo mediante el uso continuo de propofol. El corazón quedó expuesto mediante una toracotomía anterolateral izquierda que ingresa al tórax a través del cuarto espacio intercostal. Se indujo anticoagulación sistémica con 400 UI de heparina por kilogramo. Mediante canulación venosa arterial femoral y auricular derecha se estableció circulación extracorpórea normotérmica. En la derivación, se administraron 0,01 mg/kg de fentanilo y 0,02 mg/kg de pancuronio para garantizar la anestesia. Con el corazón latiendo, se seccionó la arteria pulmonar y se extrajeron un segmento de la arteria pulmonar principal y las 3 valvas nativas. El conducto valvular se implantó utilizando suturas continuas de monofilamento 5-0 (Prolene, Ethicon, Inc). La heparina se revirtió con 300 UI de protamina por kilogramo después de retirar el bypass. Se cerró la pared torácica por planos mediante suturas reabsorbibles y se administró bloqueo del nervio intercostal con bupivacaína al 0,25%. No se le administró más anticoagulación. Todos los animales recibieron 1000 mg de cefazolina (Apothecon) diariamente durante la primera semana postoperatoria. Para el control del dolor, se administraron inyecciones intramusculares de buprenorfina durante los primeros 3 días y posteriormente según fuera necesario. Todos los animales recibieron atención humana de conformidad con la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio” publicada por los Institutos Nacionales de Salud (publicación de los Institutos Nacionales de Salud No. 85-23, revisada en 1985). La ecocardiografía se realizó a las 4 y 8 semanas después del implante.
En los Países Bajos, todos los animales procedían de una granja local y fueron criados con fines educativos. A su llegada se comprobó su estado de salud general. Fueron colocados en aclimatación procesal durante al menos 14 días antes del experimento. Realizamos una evaluación detallada del bienestar animal una vez por semana, durante la cual todos los animales fueron examinados minuciosamente para detectar cualquier síntoma clínico o malestar. Todos los animales se alojaron socialmente en grupos de 2 a 10 animales, sobre lechos de paja de trigo (Nijssen Fourages, Nieuw-Vennep, Países Bajos). Los animales fueron alimentados con pellets de alimento para ovejas (250 gr por día; Kasper Faunafood, Woerden, Países Bajos) y tuvieron acceso ad libitum a heno de pradera (Nijssen Fourages, Nieuw-Vennep, Países Bajos) y agua del grifo. Las ovejas se alojaron en una habitación con aire acondicionado, una temperatura que oscilaba entre 15 y 21 °C y un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h. Para la implantación se siguió el siguiente protocolo: El tratamiento antibiótico se inició 2 días antes de la cirugía y se continuó hasta 5 días después de la cirugía con bencilpenicilina procaína/dihidroestreptomicina (1 ml/20 kg IM, Depomicina, 200.000 IE/200 mg/ml, MSD Animal Health , Kenilworth, Estados Unidos). Se pegó con cinta adhesiva un parche de buprenorfina (parche de 5 mcg/h; BuTrans, Mundipharma, Cambridge, Reino Unido) en el lado ventral afeitado de la parte proximal de la cola un día antes de la cirugía de la válvula aórtica para proporcionar analgesia preventiva. El día de la cirugía, ketamina/hidroclorina (10 mg/kg IM; Narketan 100 mg/ml, Vétoquinol, París, Francia) y midazolam (0,4 mg/kg IM; Midazolam Actavis 5 mg/ml, Actavis, Nueva Jersey , EE. UU.) se administraron como medicación preanestésica. Se utilizó propofol para inducir (2 a 4 mg/kg IV; Propofol 20 mg/mL, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Alemania) y mantener la anestesia (20 mg/kg/h IV) durante la cirugía. Se administró sufentanilo (5 μg/kg IV; Sufentanil-Hameln, 50 mcg/ml, Hameln, Gloucester, Reino Unido) para aliviar el dolor durante la cirugía. Se añadió una dosis única de clorhidrato de amiodarona (300 mg IV, Corda¬rone 50 mg/mL, Sanofi, París, Francia) a la bolsa de infusión de solución salina antes de iniciar la circulación extracorpórea (CEC). El alivio del dolor consistió en un parche de buprenorfina (parche de 5 mcg/h, BuTrans, Mundipharma, Cambridge, Reino Unido) 1 día antes de la cirugía hasta el día 7 después de la cirugía, flunixinameglumina (0,02 ml/kg IM, Niglumine, 50 mg/ml, Dopharma , Raamsdonksveer, Países Bajos) el día 1 después de la cirugía hasta el día 3 y meloxicam (1 mg/kg por vía oral, Metacam, 20 mg/ml, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemania) desde el primer día después de la cirugía hasta el día 30. Como anticoagulación , Se administró nadroparina (3800 IE IM, Fraxiparina, 9500 IE/ml, Aspen, Durban, Sudáfrica) desde el día 1 hasta el día 30 después de la cirugía. Se administró furosemida (20 mg IM, Centrafarm, 20 mg/2 ml, Furosemide, Etten Leur, Países Bajos) como medicamento diurético entre el día 1 y el día 7. Se administró depomicina como antibiótico diariamente durante la primera semana posoperatoria. Las mediciones ecográficas se tomaron directamente después de la implantación, 2 meses y 1 día antes de la explantación.
Mientras continuaba la administración de anestesia de mantenimiento durante la exploración por resonancia magnética, los animales fueron transportados al quirófano después de la exploración por resonancia magnética, después de lo cual se inició el procedimiento de explante de válvula. El gradiente de presión sobre la válvula pulmonar se midió de forma invasiva en el ventrículo derecho y la arteria pulmonar, tras lo cual los animales fueron desangrados bajo anestesia total. Posteriormente, la prótesis de válvula cardíaca se explantó cuidadosamente y se almacenó en formaldehído al 10% durante 24 h antes de transferirla a PBS. Se recogieron muestras de hígado, pulmones, bazo, riñones, ventrículo izquierdo y ventrículo derecho y se almacenaron en formaldehído al 10% durante 24 h antes de transferirlas a PBS.
El día del explante, todas las ovejas se sometieron a una resonancia magnética cardíaca en un escáner Ingenia de 1,5 T (Philips, Países Bajos) bajo anestesia total (técnicos de resonancia magnética Anke Wassink y Raschel van Luijk, Países Bajos). Además, a tres ovejas adicionales a las que no se les implantó una válvula cardíaca se les realizó una resonancia magnética de manera similar, para que sirvieran como controles sanos. El día de la resonancia magnética, todos los animales recibieron ketamina/hidroclorina (10 mg/kg IM; Narketan 100 mg/ml, Vétoquinol, París, Francia) y midazolam (0,4 mg/kg IM; Midazolam Actavis 5 mg/ml, Actavis, Nueva Jersey, EE. UU.) como preanestésico. Se utilizó propofol como anestesia de inducción (2 a 4 mg/kg IV; Propofol 20 mg/ml, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Alemania) y como anestesia de mantenimiento (4 a 7 mg/kg IV; Propofol 20 mg/ml, Fresenius Kabi , Bad Homburg, Alemania) además de sufentanilo (5 μg/kg IV; Sufentanil-Hameln, 50 mcg/ml, Hameln, Gloucester, Reino Unido).
Los volúmenes sistólico y diastólico se evaluaron mediante una secuencia de precesión libre en estado estacionario retrospectiva activada por electrocardiograma. Se adquirieron vistas verticales de eje largo de 2 y 4 cámaras y vistas de eje corto que constan de 12 a 14 cortes contiguos, que cubren ambos ventrículos desde la base del corazón hasta el ápice. Los parámetros de escaneo fueron; tiempo de repetición = 3,2 a 3,8 ms; tiempo de eco = 1,6 a 1,9 ms; ángulo de giro = 50–70o; espesor de corte = 6–8 mm sin espacio entre cortes; matriz = 160 × 256; campo de visión = 350–400 mm y resolución temporal de aproximadamente 25 ms.
RMC 2D La dinámica del flujo a través de la arteria pulmonar se evaluó mediante una secuencia de resonancia magnética retrospectiva codificada por velocidad activada por electrocardiograma. La secuencia se codificó para una velocidad a través del plano de 150 cm/s o superior según el grado de la arteria pulmonar principal. Los parámetros de escaneo fueron tiempo de repetición = 9 ms, tiempo de eco = 5 ms, ángulo de giro = 15–20o, espesor del corte = 6–8 mm, matriz = 128 × 256, resolución temporal de aproximadamente 20 ms.
La función sistólica biventricular y el flujo 2D se analizaron con el software CVI 42 (Circle Cardiovascular Imaging, Calgary, Canadá). La función sistólica biventricular se evaluó dibujando los contornos endocárdicos del VI y del VD al final de la diástole y al final de la sístole en todas las secciones del cine de corta duración. datos del eje. Los volúmenes telediastólicos (EDV) y telesistólicos (ESV) se obtuvieron y indexaron para el área de superficie corporal según la fórmula de Mosteller: (√ Altura (cm) × peso (kg)/3600). El volumen sistólico ventricular indexado según el área de superficie corporal se calculó restando el ESV del EDV. La fracción de eyección se calculó dividiendo el volumen sistólico por el EDV.
Se dibujaron contornos vasculares de la arteria pulmonar para generar curvas de flujo versus tiempo a lo largo del ciclo cardíaco. Se midieron el flujo hacia adelante, el flujo hacia atrás y el flujo neto. El gasto cardíaco (CO) (flujo pulmonar neto) se midió como el producto del flujo neto y la frecuencia cardíaca. El índice cardíaco (IC) (flujo pulmonar) fue indexado por CO al área de superficie corporal (BSA).
Se realizó CFD para visualizar patrones de flujo, desarrollo helicoidal de "vórtice" a través del PA, LPA y RPA principales a través de líneas de corriente codificadas por colores, velocidades vectoriales, gráficos de contorno de vorticidad y helicidad utilizando Fluent (ANSYS Inc., Canonsburg, PA, EE. UU.) . La reconstrucción 3D (segmentación) de los principales PA, LPA y RPA se realizó utilizando Mimics (Materialise NV, Bélgica) para definir el dominio del CFD. El dominio fluido se definió como sangre con una densidad de 1060 kg/m3 y una viscosidad de 0,0035 Pa s. Las condiciones límite se definieron utilizando una condición límite de entrada de datos de velocidad al nivel de la válvula y condiciones límite de presión de salida en LPA y RPA. Los datos de velocidad de entrada se derivaron de datos de caudal CMR 2D al nivel de la válvula.
El área de la sección transversal de la raíz en el máximo abultamiento del seno se utilizó para calcular la deformación circunferencial de la raíz. Esto se calculó como (Amax-Amin)/Amin, donde Amax y Amin representan las áreas máxima y mínima, respectivamente, durante el ciclo cardíaco.
Se lavaron un total de secciones de ILT de parafina de 5 μm de espesor con agua del grifo, se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 5 minutos y luego se lavaron con agua del grifo; luego, los portaobjetos se incubaron con tinción de eosina al 1% durante 5 minutos. Se enjuagó brevemente con agua del grifo y se deshidrató rápidamente con metanol graduado, se aclaró en xileno y se montó en DPX.
Se lavaron secciones de parafina de 5 μm de espesor en agua destilada y se tiñeron con hematoxilina Weigerts durante 10 minutos. seguido de un lavado con agua del grifo y un lavado con agua destilada, las secciones se incubaron con azul alcián al 3 % durante 20 minutos, seguido de ácido molibdofosfórico al 1 % durante 20 minutos. Después de un breve lavado con agua destilada, las secciones se tiñeron con rojo Sirio/ácido pícrico durante 60 min. Los portaobjetos teñidos se lavaron brevemente en agua destilada, se deshidrataron rápidamente con metanol graduado, se aclararon con xileno y se montaron en DPX.
Se lavaron secciones de parafina de 5 μm de espesor en agua destilada, se enjuagaron con metanol al 100%, se sumergieron en tinción de elastina de Miller (VWR) durante 2 h a temperatura ambiente, se diferenciaron en metanol al 90% durante 10 a 20 s, se lavaron bien con agua del grifo y luego agua destilada, sumergido en tinte de Van Giesson durante 5 min, enjuagado brevemente en agua destilada, deshidratado rápidamente a través de metanol graduado, aclarado en xileno y montado en DPX.
Las válvulas se explantaron a la semana, 2 semanas, 9 semanas, 13 semanas y 26 semanas y se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 h. La raíz anterior, la raíz posterior izquierda y la raíz posterior derecha se diseccionaron y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, las muestras se sumergieron en formol salino al 10% y se procesaron para obtener bloques de parafina. Se cortaron secciones de parafina de 5 µm de espesor, se desparafinaron y se rehidrataron en agua. El retorno del antígeno se llevó a cabo en tampón citrato 0,1 M (pH 6) y se calentó en el microondas durante 10 minutos a alta potencia, se dejó enfriar durante 20 minutos más antes de bloquear las peroxidasas endógenas utilizando peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS. Las secciones se lavaron dos veces en PBS y se bloquearon usando suero de caballo normal al 10 % en albúmina sérica bovina al 2 % (p/v) (BSA) en PBS que contenía Tween-20 al 1 % v/v, seguido de incubación con los anticuerpos primarios enumerados en la tabla complementaria. 1, toda la noche en el frigorífico. Luego se eliminaron los anticuerpos primarios lavando las secciones 3 veces en PBS seguido del kit Vectastain (R) Elite ABC-HRP, peroxidasa RTU (kit universal). La reactividad se detectó usando tetrahidrocloruro de diaminobencidina (tabletas DAB - Sigma) (25 mg/ml) e hidrógeno. peróxido (0,01% p/v). Luego, las secciones se tiñeron con hematoxilina de Mayers y los portaobjetos teñidos se escanearon con Hamamatsu Nanozoomer.
Antes de la tinción por inmunofluorescencia, se desparafinaron secciones de parafina de 5 µm de espesor de explantes de oveja y se rehidrataron en agua. La recuperación del antígeno se llevó a cabo calentando los portaobjetos en el microondas en tampón citrato 0,1 M. Para reducir la unión no específica, los portaobjetos se incubaron con suero de cabra normal al 10% en albúmina sérica bovina al 2% (BSA -Sigma) durante 40 minutos. Luego, las muestras se incubaron durante la noche en una cámara húmeda con un cóctel de anticuerpos que consistía en alfa actina del músculo liso (ratón de DAKO) y CD31 (conejo-Abcam). Los controles negativos consistieron en suero de cabra normal al 10 % en BSA al 2 % en PBS. Después de un lavado minucioso, todas las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios, Alexa Fluor 634 anticonejo de cabra para policlonales de conejo y Alexa Fluor 488 antiratón de cabra (Life Technologies) durante 1 hora a una dilución 1:1000. Después de lavar varias veces con PBS, las secciones se incubaron con DAPI (1:5000) (sigma) durante 15 minutos y para reducir la autofluorencia, las secciones se incubaron con el kit de extinción Vector TrueView (laboratorios Vector) durante 3 minutos y se montaron usando Permafluor (Beckman Coulter). . Se tomaron imágenes de las secciones teñidas utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880.
La tinción con plata para los nervios se llevó a cabo según el método de tinción con plata de Bielschowsky, como se describe en Teoría y práctica de técnicas histológicas de Bancroft y Stevens60.
Se extirparon trozos de tejido (2 mm2) de diferentes regiones de la válvula remodelada y se fijaron en glutaraldehído al 3% (Agar Scientific Ltd., Essex, Reino Unido) en tampón cacodilato 0,1 M durante 2 h. Después de dos lavados con tampón, se llevó a cabo la fijación secundaria con tetróxido de osmio al 1% (Agar Scientific Ltd.) en tampón cacodilato 0,1 M durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se deshidrató la muestra mediante una serie creciente de etanol, comenzando con etanol al 25%. Después de la deshidratación, el tejido se transfirió a óxido de propileno (Sigma-Aldrich, Reino Unido). Luego se infiltró el tejido con óxido de propileno:resina Araldite CY212 1:1 durante la noche. Después de dos cambios de resina fresca, por un mínimo de 3 h cada uno, el tejido se embebió en resina Araldite CY212 y se polimerizó a 60 °C durante 18 h. Se cortaron secciones ultrafinas con una cuchilla de diamante Diatome en un ultramicrotomo Reichert-Jung Ultracut E, se hicieron flotar en agua destilada, se recogieron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo durante 10 minutos en cada solución. Las secciones teñidas se observaron en un microscopio electrónico JEOL 1200 y se tomaron imágenes digitales con una cámara Gatan.
Se fijaron trozos de muestras de valvas valvulares y de paredes sinusales en glutaraldehído al 2,5 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 2 h a temperatura ambiente. Después de 2 lavados con tampón, la fijación secundaria con tetróxido de osmio al 1% en tampón cacodilato 0,1 M se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 h. Las muestras se deshidrataron en series ascendentes de etanol a partir de etanol al 20%. Luego, las muestras se trataron con hexametil disilazano (HMDS-Sigma) tres veces durante 2 minutos en cada solución, se secaron al aire y se montaron en trozos de SEM. Los trozos se recubrieron con oro y se observaron en JEOL JSM-5500 LV SEM (JEOL UK Ltd). Todos los productos químicos se obtuvieron de Agar Scientific Ltd, Stanstead, Essex, Reino Unido.
Como uno de los explantes de 9 semanas mostró un nódulo calcificado, se llevó a cabo un análisis elemental mediante espectroscopia de rayos X de dispersión de energía en una sección de cera de parafina de 10 μm de espesor desparafinada y rehidratada, se secó al aire y se montó en trozos de SEM recubiertos con oro/ Paladio utilizando un microscopio electrónico de barrido analítico JEOL 6010.
Se sumergió una muestra (tamaño de 5 mx 5 mm) de compuesto de tejido/andamio con NaOCl al 5 % (sigma) durante 1 h para eliminar el tejido biológico, seguido de un lavado 3 veces en H2O dH, el componente PCL se disolvió en 2 ml de cloroformo (Sigma ), seguido de secado al aire y redisuelto con THF (VWR) en una solución de PCL/THF de 1 mg/ml. Las muestras se prefiltraron con un filtro de PTFE a 0,2 µm antes del análisis. Las muestras se analizaron mediante un sistema de cromatografía de exclusión por tamaño/GPC Agilent 1260 infinity II con un caudal de 1 ml/min a 25 °C. Los pesos moleculares promedio en peso (Mw) del PCL se calcularon utilizando la curva estándar del estándar de poliestireno (Agilent infinity lab EasiVial) (Mn, EXP = X × Mn, SEC) con coeficientes de corrección X = 0,6 para PCL como se determinó previamente61.
Todas las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando GraphPad Prism v10.0.1. Se probó la normalidad de todos los datos, a menos que se indique lo contrario. Análisis de pruebas hidrodinámicas in vitro: Las comparaciones estadísticas entre el grupo de control (válvula Freestyle Medtronic) y el grupo experimental (HCCV) se realizaron mediante una prueba t de dos colas, con un tamaño de muestra de n = 4, muestras independientes para cada grupo. Se consideró estadísticamente significativo para el análisis un valor de p inferior a 0,05.
Análisis de cepas: Se realizaron comparaciones estadísticas entre el grupo HCCV y el grupo de control (ovejas nativas) utilizando una prueba t de dos colas, asumiendo una varianza desigual. El tamaño de la muestra fue n = 5 (muestras biológicamente independientes) para el grupo HCCV y n = 3 (muestras biológicamente independientes) para el grupo control. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Morfometría de HCCV (n = 4, muestras biológicamente independientes) y análisis GPC (n = 3, muestras biológicamente independientes): Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey post-hoc. El espesor de las valvas del VHC antes y después de la implantación se comparó mediante una prueba de Mann Whitney de dos colas y un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.
Los datos de origen están disponibles en los datos complementarios.
El código Matlab personalizado para el análisis GOA está disponible gratuitamente a través de Github bajo licencia pública general. El código está disponible en https://doi.org/10.5281/zenodo.8275999.
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El estudio fue apoyado por Heart Biotech y el Instituto Magdi Yacoub.
Instituto Magdi Yacoub, Harefield, Reino Unido
Magdi H. Yacoub, Yuan-Tsan Tseng, Padmini Sarathchandra, Adrian H. Chester y Najma Latif
Instituto Nacional del Corazón y los Pulmones, Imperial College London, Londres, Reino Unido
Magdi H. Yacoub, Yuan-Tsan Tseng, Ulrich Stock, Padmini Sarathchandra, Adrian H. Chester y Najma Latif
Centro de Ciencias del Corazón de Assam, Fundación Magdi Yacoub, Assam, Egipto
Magdi H. Yacoub, Hussam El-Nashar, Nairouz Shehata, Mohamed Nagy, Amr El-sawy y Soha Romeih
Departamento de Cirugía Cardiotorácica, Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos
Jolanda Kluin
Amsterdam UMC, Universidad de Amsterdam, Departamento de Cirugía Cardiotorácica, Amsterdam, Países Bajos
Annemijn Vis
Royal Brompton y Harefield Hospital, Londres, Reino Unido
Ulrich Stock, Hassiba Smail y Wei Li
Medicina Cardiovascular, Hospital Brigham and Women's, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, EE. UU.
Elena Enviar
Departamento de Bioingeniería, Imperial College London, Londres, Reino Unido
Hussam El-Nashar
Departamento de Computación, Imperial College London, Londres, Reino Unido
Nairouz Shehata
Laboratorio de Ingeniería Cardiovascular, UCL Ingeniería Mecánica, University College London, Londres, Reino Unido
Gaetano Burriesci y Jacob Salmonsmith
Unidad de Bioingeniería, Fundación Ri.MED, Palermo, Italia
Gaetano Burriesci
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MHY, Y.-TT y NL contribuyeron igualmente a la concepción del estudio, el diseño experimental, la gestión del proyecto, la supervisión y la redacción del manuscrito original. MHY aseguró la financiación. MHY, Y.-TT, NL y HE fueron responsables del diseño y fabricación de la válvula HCCV. Y.-TT, GB, JS, HE, AHC y NS diseñaron y ejecutaron la validación in vitro de la construcción. JK, AV, US, HS, Y.-TT y NL realizaron estudios in vivo y supervisaron la adquisición de datos. Analizamos las imágenes del eco. ÉL y AE-S. realizó el análisis CFD. SR, MN, AE-S., HE y NS realizaron el análisis CMR. NL, PS, MHY, YT.T. y EA llevaron a cabo el análisis de los explantes. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.
Correspondencia a Magdi H. Yacoub.
Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: MHY, Y.-TT y NL poseen acciones de Heart Biotech. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.
Communications Biology agradece a Yuanjia Zhu y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Ngan F. Huang y Joao Valente.
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Reimpresiones y permisos
Yacoub, MH, Tseng, YT., Kluin, J. et al. Valvulogénesis de una raíz pulmonar viva inervada inducida por un andamio acelular. Común Biol 6, 1017 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05383-z
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Recibido: 13 de diciembre de 2022
Aceptado: 21 de septiembre de 2023
Publicado: 07 de octubre de 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05383-z
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